2013年の研究で、アルミニウムナノ粒子が脳血液関門を通過することが示されていた
ナノアルミナ＝アルミニウムナノ粒子のこと。
ナノアルミナへの曝露は、
・用量依存的なミトコンドリア電位の崩壊
・脳内皮細胞のオートファジーの増加
・タイトジャンクション蛋白であるオクルディンおよびクラウディン-5の発現減少（＝BBB透過性の上昇）
を誘発した。
ナノアルミナによって引き起こされる中枢神経系の神経血管毒性には、オートファジーが重要なメカニズムとして関与していることが明らかになった。
ナノアルミナによる脳血管障害にオートファジーが関係している
要旨
本研究では、人工ナノ材料によって引き起こされる血液脳関門（BBB）の破壊と神経血管障害に焦点を当てた。ナノアルミナへの曝露は、ナノカーボンへの曝露と異なり、用量依存的なミトコンドリア電位の崩壊、脳内皮細胞のオートファジーの増加、タイトジャンクション蛋白であるオクルディンおよびクラウディン-5の発現減少を誘発した。Wortmannin（ウォルトマンニン）による前処理でオートファジーを抑制すると、ナノアルミナのクラウディン-5発現を減少させる作用は減弱したが、オクルディンの破壊には影響を与えなかった。これらの知見は，マウスにナノアルミナを脳循環に投与することによって確認された。ナノアルミナの全身投与により、脳内のオートファジー関連遺伝子とオートファジー活性が上昇し、タイトジャンクションタンパク質の発現が低下し、BBB透過性が上昇した。最後に、ナノアルミナへの曝露は、局所虚血性脳卒中モデルマウスの脳梗塞体積を増加させたが、ナノカーボンへの曝露は増加させなかった。このように、ナノアルミナによって引き起こされる中枢神経系の神経血管毒性には、オートファジーが重要なメカニズムとして関与していることが明らかになった。
はじめに
近年、ナノテクノロジーは急速に発展しており1、その製品である人工ナノ材料（ENM）は、産業用途、消費者製品、医療分野で幅広く利用されている1,2。しかし、ENMはその独特の小さなサイズ、電荷、表面反応性により、環境や人間の健康に悪影響を与える可能性がある3-6。ENMは、細胞膜を容易に透過し、細胞小器官と結合し、核に侵入し、正常な細胞機能を破壊する可能性があります。
ナノアルミナは、工業的に広く使用されており、最も多く製造されている ENM の 1 つである。アルミニウムは細胞膜の破壊者として作用し、いくつかの神経変性疾患の病因として関与している4,5。アルミニウムへの曝露が、酸化ストレス、炎症性事象、および血液脳関門（BBB）の破壊の増加に寄与する可能性があるという証拠が存在する。しかしながら、ナノアルミナは、バルク材料と比較して、異なる毒性スペクトルを有する可能性がある。実際、我々の以前の研究でも、ナノアルミナはミクロンサイズ以上ではアルミナよりもはるかに高い毒性を示すことが示されている6。
BBBは、血液と脳の間で栄養素や代謝物の交換を活発に行うとともに、免疫細胞や血漿成分の脳への侵入を制限する役割を担っています。タイトジャンクションは、中枢神経系への病的損傷や複数の神経変性疾患において、BBBの制御に決定的に重要であることを示す証拠が増えつつあります。
オートファジーは、様々な細胞機能と細胞死に関与する、高度に保存されたタンパク質分解経路である。正常な状態あるいは低レベルの細胞ストレスの下では、細胞質の再利用と欠陥のある小器官の処分が行われる。8 細胞ストレスの制御におけるオートファジーの重要な役割に鑑みて、我々はナノアルミナ処理によるその活性を調べた。我々は、細胞内または全身へのナノアルミナ投与がミトコンドリア機能障害とオートファジー活性を誘発し、BBB機能を破壊し、虚血性脳卒中を悪化させることを証明する。
結果
ナノアルミナはHCMECに入り、BBBを通過して脳内に蓄積される
ARS-ナノアルミナ（1μg/mL、赤色に染色）は、2時間の処理後、HCMECで検出された（図1A、中央のパネル、矢印）。12時間の処理後、ARS-nanoaluminaは、MitoTracker Greenによる染色で評価したように、クラスター化したミトコンドリアの近傍に凝集体として見られた（図1A、右図、矢印）。
図1
ナノアルミナはHCMECに入り、脳に蓄積される
A. 培養HCMECを1 μg/mLのARS標識ナノアルミナ（赤色染色）に指示された時間曝露した。細胞はミトコンドリアを可視化するためにMitoTracker Green（緑色染色）と共染色した。ARS-ナノアルミナは、曝露後2時間でHCMEC内部に確認でき（矢印）、12時間曝露後はクラスター化したミトコンドリアの近傍に凝集体として確認できた（矢印）。B. ARS-nanoalumina投与1時間後の脳血管へのナノアルミナの局在。脳血管はFactor VIIIに対する抗体、アストロサイトはGFAPに対する抗体を用いて可視化（緑色）した。ARS-nanoaluminaは脳血管に局在し（左図、矢印）、血管周囲のアストロサイトに存在する（矢印）。C. ナノアルミナは注入後1週間まで脳内に検出される。ARS-ナノアルミナは投与24時間後および1週間後ともに脳実質内に拡散したパターンを示す（矢印）。
脳内におけるナノアルミナの運命を明らかにするために，ARS-ナノアルミナを1.25 mg/kgの用量で頸動脈から脳循環系に注入した．脳内皮はFactor VIII，アストロサイトはGFAPの染色により検出された．ARS-nanoaluminaは注入1時間後に脳内皮と共局在化し（図1B、左図、矢印）、脳血管周囲のアストロサイトにも存在した（図1B、右図、矢印）。注入24時間後、ARS-nanoaluminaはアストロサイトに近接して脳実質に拡散したパターンを示した（図1C、左パネル）。注入後1週間のARS-nanoaluminaの分布（図1C、右図）は、注入24時間後と同様の分布パターンを示し、ナノアルミナは脳内に蓄積され、脳成分から排除されないことが示された。
ナノアルミナによるミトコンドリア電位の低下は、オートファジー活性の上昇に関連している
図 1A で見られたナノアルミナのミトコンドリアへの局在は、ミトコンドリア電位への影響を明らかにすることを促した。HCMECをナノアルミナ（1μg/mL）で6時間処理し、MitoTracker Redで染色した。さらに、自食空胞のマーカーとしてモノダンジルカダベリン（MDC）でも染色した。対照細胞では、ミトコンドリアは正常に染色され（図 2A、赤色染色）、自食空胞の存在は最小限であった（図 2A、青色染色、矢印）。ナノアルミナの投与量を増やした処理では、ミトコンドリアの拡散染色が徐々に増加し、膜電位の喪失を示 した。これらの変化は、MDC 染色の顕著な強度の上昇と相関していた。特異的なPI3K阻害剤でありオートファジーの阻害剤であるワートマニンでの処理は、1μg/mLナノアルミナによって誘発されたオートファジー空胞の形成から保護した。重要なことは、ナノカーボン（nC、1.2μg/mL）で処理しても、ミトコンドリア電位やMDC陽性染色は変化しなかったことである。1μg/mLのナノアルミナで6時間処理した際の変化したミトコンドリアとオートファジー液胞の形成の関連性を図2Bに詳しく示す。オートファゴリソソームの形成を決定するために、LysoTracker Greenで追加染色を行った。マージされた画像は、拡散したミトコンドリア、リソソーム、およびオートファジー小胞の共局在化を示している。
図2
ナノアルミナ処理によるミトコンドリア破壊とオートファジー活性の誘導
A. HCMEC を指定濃度のナノアルミナで 6 時間処理し、ミトトラッカーレッド（ミトコンドリアマーカー、赤色染色） とモノダンシリカダベリン（MDC、自食胞のマーカー、青色染色）で染色を行った。統合された画像は、クラスター化したミトコンドリアと自己貪食胞の共局在化を示している（矢印）。選択した培養物をワートマニン（100 nM、1時間、PI3K阻害剤およびオートファジー阻害剤）で前処理するか、ナノカーボン（1.2 μg/mL、6時間）またはクロロキン（50 μM、1時間、オートファジー誘発の陽性対照）に曝露した。B. ナノアルミナによって誘導されたHCMECにおけるオートファゴリソソームの形成。A）から1μg/mLナノアルミナに6時間暴露した培養物の拡大画像は、変化したミトコンドリア（MitoTracker Redで染色）、リソソーム（LysoTracker Greenで染色）およびオートファジー液胞（MDCで染色）の共局在化を示している。合併画像の矢印はオートファゴリソソーム内のミトコンドリアのクラスターを示す。C. マウスにナノアルミナ（1.25 mg/kg）またはビヒクルを頸動脈から投与し、投与 24 時間後に大脳皮質における ATP レベルを評価した。データは平均±SEM、n=3-5。***ビヒクル投与動物と比較して、p<0.001で有意に異なる。
ミトコンドリアは、細胞内ATPの主な生産者である。そこで、ナノアルミナへの曝露がミトコンドリア機能に影響を及ぼすことの原理的証明として、ATPレベルを測定した。ナノアルミナを投与した場合、ビヒクルを投与した動物と比較して、ATP レベルが劇的に減少した。
ナノアルミナはオートファジー遺伝子とタンパク質の発現を促進する
頸動脈からナノアルミナ（1.25 mg/kg）またはビヒクルを投与して24時間後に、マウス脳をマウスオートファジーPCRアレイにかけた。調べた84個のオートファジー関連遺伝子のうち、13個の遺伝子が2倍以上の増加を示した。これらの遺伝子と微小管関連タンパク質1軽鎖3（MAP1LC3アルファおよびベータ）をコードする遺伝子を図3Aに示す。Gene Annotation Tool to Help Explain Relationships (GATHER)で解析したところ、上昇した遺伝子は相互に関連していた。それらは3つのKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) パスウェイ、すなわちpath:mmu04210: Apoptosis, path:mmu04060 に豊富にクラスター化していた。Cytokine-cytokine receptor interaction、path:mmu04010: MAPKシグナル伝達経路である。研究対象遺伝子のうち、tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 10のみが2倍以上ダウンレギュレートされていた。 この結果を確認するために、従来のリアルタイムPCRでLC3遺伝子の発現を測定した。図3Bに示すように、ナノアルミナ曝露マウスの脳では、LC3 mRNAが1.6倍上昇した。
図3
ナノアルミナ曝露マウスの脳でオートファジー関連遺伝子の発現が誘導されること
A. マウスを図1Bと同様にナノアルミナに24時間曝露し、全脳抽出液中のオートファジー関連遺伝子をmouse Autophagy PCR Arrayで解析した。B. LC3をコードする遺伝子の発現は、リアルタイムPCRで確認した。結果は、平均±SEM、n=4。**, p<0.01; または ***, p<0.001で、（空の）運搬体投与マウスと比較して有意な差がある。
また、オートファジーのマーカーとして頻繁に用いられる2つのタンパク質、すなわちLC3とp62を測定した。オートファジーでは、細胞質型のLC3（LC3-I）がホスファチジルエタノールアミンに結合し、LC3-ホスファチジルエタノールアミン（LC3-II）を形成する。LC3は、p62のLC3-interacting region (LIR)に、そのN末端の塩基性残基とp6215の酸性クラスターとの相互作用によって結合している。p62とLC3の複合体はオートファゴソームに局在し、オートファジー-リゾソーム系を通じて分解される。図4Aに示すように、ナノアルミナでHCMECを6時間処理すると、LC3およびp62タンパク質レベルの両方が増加することが示された。重要なことは、ナノアルミナへの曝露により、LC3-IIの形成が増加し、これはオートファジー過程の進行と一致することである。ナノカーボンの処理でも、p62のレベルが上昇し、ナノアルミナほどではないが、LC3のレベルも上昇した。
図4
ナノアルミナは、HCMECおよび曝露されたマウスの脳においてオートファジー関連タンパク質の発現を誘導する
A. HCMECを指定濃度のナノアルミナまたは1.2μg/mLナノカーボン（nC）に24時間暴露し、オートファジーマーカータンパク、LC3およびp62を免疫ブロッティングにより分析した。B. マウスに頸動脈からナノアルミナ1.25 mg/kgを曝露した。LC3およびp62タンパク質は、ナノアルミナ曝露後1、3および30日目に分析された。A）および（B）のブロットは、4つの独立した実験からの代表画像である。結果は、平均値±SEMである。**, p<0.01; または ***, p< 0.001で、コントロール（車両で処理した細胞またはマウス）と比較して有意な差がある。1.2 μg/mL nCに曝露した細胞のデータは、10 μg/mL nanoalumina に曝露した細胞と比較して、p<0.05で有意に異なっている。C. 脳切片をファクターVIII（内皮のマーカー）、GFAP（アストロサイトのマーカー）、LC3タンパク質（赤色染色）でナノアルミナ注入後3日および30日目に染色した。3日目では、LC3は脳血管に関連していた。30日目には、脳実質にLC3の存在が検出された。
HCMECで得られた結果と同様に、LC3およびp62タンパク質の増加がナノアルミナ注入後24時間で観察され、ナノアルミナ投与後30日間も上昇したままであった（図4B）。本研究で使用した抗LC3抗体は、細胞培養サンプルではLC3-IとLC3-IIを確実に検出できるが、脳組織では検出できないことに注意すべきである。そのため、図4Bでは1本のLC-3バンドのみが可視化されている。
LC3陽性免疫反応性の脳内分布を図4Cに示す。LC3染色は、注入後3日目に脳微小血管（第VIII因子陽性染色により同定）に沿って顕著であり、ナノカーボンはそのような効果を欠いた。ナノアルミナ投与30日後、LC3免疫反応性は脳実質全体に認められ、アストロサイトの近傍で確認された。
ナノアルミナによるタンパク質分解は、オートファゴリソソームの形成と相関している
赤色蛍光色素BODIPY TR-Xで標識したウシ血清アルブミン（BSA）ベースのプローブであるDQ-BSAを用いて、HCMECにおいてタンパク質分解に対するナノアルミナの効果を評価した。ビヒクル処理した細胞は、わずかな基礎レベルのタンパク質分解（赤色蛍光で表示）を示したが、ナノアルミナ処理により、DQ-蛍光の活性が用量依存的に上昇した（図5A）。重要なことは、タンパク質分解活性は、LysoTracker Greenによる染色で評価したように、オートファゴリソソームと一致する酸性小胞の形成と相関していたことである。1.2 μg/mLのナノカーボンで処理しても、タンパク質分解活性とオートファゴリソソーム様構造が誘導されたが、等モル濃度のナノアルミナと比較すると程度は小さかった。
図5
ナノアルミナはタンパク質分解を上昇させ、タイトジャンクションタンパク質の破壊を誘発する
A. 次に、タンパク質分解のための外因性基質としてDQ-BSAを細胞に負荷し、リソソームとオートファゴリソームを検出するためにLysoTracker Greenで共染色し（緑色染色）、核を可視化するためにDAPIで染色した。矢印はDQ-BSAのタンパク質分解による蛍光産物を示す。B. HCMECをAと同様にナノアルミナで処理した。選択した培養物をWortmannin（100 nM）で1時間前処理した後、10 μg/mLナノアルミナに24時間曝露した。 その後、タイトジャンクションタンパク質であるクローディン-5とオクルディンの発現をイムノブロットで評価した。結果は、平均値±SEMである。***ビヒクル処理した細胞と比較して、p<0.001で有意に異なる。Wortmanninで前処理し、10μg/mLナノアルミナに暴露した細胞のデータは、10μg/mLナノアルミナ単独に暴露した細胞と比較して、p<0.05で有意に異なっている。C. 図1Bと同様にマウスにナノアルミナ（1.25 mg/kg）を注射し、注射後1、3、5、30日目にクローディン-5とオクルディンのレベルを評価した。さらに、選択したマウスに等モルレベルのナノカーボン（nC）を注射し、投与30日後にクローディン-5およびオクルディンのレベルを分析した。**, p<0.01; または ***, p<0.001で、ビヒクル投与マウスと比較して有意に異なる。nCに30日間曝露したマウスのデータは、ナノアルミナに30日間曝露したマウスと比較して、p<0.05で有意に異なる†。D. C と同様にマウスにナノアルミナ（nAl）またはナノカーボン（nC）を投与し、投与 3 日後および 30 日後に BBB インテグリティを評価した。結果は、平均値±SEMである。*投与後3日目および30日目のBBBインテグリティを評価した結果、ビヒクルまたはナノカーボンを投与したマウスと比較して、*, p<0.05; または ***, p< 0.001 で有意に差があった。
DQ-BSAはタンパク質分解活性の外来性プローブとして機能するが、我々は脳内皮の完全性とバリア機能を制御するタイトジャンクションタンパク質であるオクルディンおよびクローディン-5のレベルに対するナノアルミナの効果も評価した。ナノアルミナへの6時間の曝露後、HCMECにおいて、オクルーディンおよびクローディン-5の発現の用量依存的な減少が検出された（図5B）。PI-3キナーゼ阻害剤でありオートファジーを阻害するWortmannin（100 nM、1時間）で前処理すると、ナノアルミナによるクローディン-5の発現変化を部分的に保護したが、オクルディンの発現は保護されなかった。
重要なことは、ナノアルミナはin vivoでのタイトジャンクションタンパク質の発現も減少させたことである。ナノアルミナ（1.25 mg/kg）を頸動脈から単回投与すると、注入後30日までオクルーディンが徐々に減少し、コントロール値より50％低いレベルに達した。クラウディン-5の減少は、オクルーディンよりも早く起こり（1日対3日）、5日間持続した。ナノカーボンの処理でもクローディン-5とオクルディンのレベルは低下したが、これらの効果はナノアルミナと比較してあまり進行しなかった（図5B）。
タイトジャンクションタンパク質の発現に対するナノアルミナの効果に関する研究は、BBBを横切る透過性を評価することによって完了した。1.25mg/kgのナノアルミナを注射すると、注射後3日目にBBB透過性が著しく上昇し、この効果は最大30日間維持された。等モル量のナノカーボンを投与した動物では、BBBの破壊は見られなかった。
ナノアルミナへの曝露は、中大脳動脈永久閉塞による梗塞体積を増加させる
最後の実験は、脳卒中の発症に対するナノアルミナの影響に焦点を当てたものであった。マウスに1.25 mg/kgのナノアルミナを脳循環に注入し、等モル量のナノカーボン、または対照物質を投与した。さらに、脳血管の流れを阻害しないように、ナノ粒子に変換されていないアルミナを選択したマウスにi.p.投与した。ナノアルミナ曝露後3日または30日目に左中大脳動脈を永久閉塞して脳卒中を誘発し、24時間後に脳卒中量を算出した。ナノアルミナへの曝露は脳卒中量を有意に増加させた。一方、ナノカーボンや通常の粒径のアルミナでは、脳卒中発症に影響はなかった。
考察
ENMs のユニークな特性は、環境と人体への悪影響について懸念を抱かせている。3,4 ENMs は、細胞膜を透過して細胞小器官に干渉し、予期せぬ、あるいは意図しない悪影響を及ぼす可能性がある。本研究では、ENMs の BBB レベルでの脳血管毒性に注目した。さらに、オートファジーはストレスに対する一般的な細胞応答として認識されているため16 、ナノアルミナが細胞および動物においてオートファジー誘導剤として機能するかどうかを評価した。脳内皮細胞および脳内皮におけるオートファジーの誘導は、マーカータンパク質であるLC3およびp62の上昇によって検出された。p62はオートファジーの選択的基質であるが15、その発現は酸化ストレス、Ras癌遺伝子、あるいはNF-κBによるフィードバック制御など、いくつかの制御機構によって制御されている。我々は以前、ナノアルミナが培養脳内皮細胞において酸化ストレスを誘発することを示した6。 重要なことは、本研究で観察されたp62の発現増加は、LC3レベルの上昇と一致することである。
細胞内のタンパク質代謝機構には、ユビキチン-プロテアソーム系（UPS）、オートファジー-リソソーム系など、いくつかのものがある。UPS は、短命のタンパク質や欠陥のあるタンパク質を分解し、急性飢餓時のアミノ酸プールを維持するための主要な経路である。一方、オートファジーは、慢性的な飢餓やストレスにおいて、主に長寿命タンパク質の分解とアミノ酸プールの維持に関与している。本研究で選択した実験条件、例えばナノアルミナによる長時間の処理と長寿命のタイトジャンクションタンパク質への注目は、オートファジーによるタンパク質分解に有利であるが、我々の実験モデルではUPSシステムの同時活性化の可能性を排除することはできない。
オートファジー過程では、オートファゴソームの形成とリソソームとの融合が、オートファゴリソソームの形成につながる最も重要なステップであり、この段階でタンパク質が分解され、アミノ酸が放出される8。最近の報告では、オートファゴソームの二重膜構造の構成にミトコンドリア膜が重要である証拠が示されている17。そこで、ナノアルミナによって機能不全となったミトコンドリアがオートファジー分解過程に入ることを示し、ナノアルミナとミトコンドリアの相互作用を検討した。
また、ナノアルミナによるミトコンドリア機能の障害は、曝露したマウスの大脳皮質における ATP レベルの劇的な低下によって、in vivo でも確認された。これらの結果は、呼吸鎖の機能不全によりミトコンドリア電位が低下し、ATP収量が減少したことと矛盾しない。オートファジーによるミトコンドリアの除去は、細胞の恒常性を維持するための細胞救済機構と見なすことができる。しかし、オートファジーが過剰に活性化すると、過剰なタンパク質分解とオートファジーによる細胞死を引き起こす可能性がある18。この考えと一致して、ナノアルミナ負荷の結果として、タンパク質分解の大幅な増加と梗塞サイズの拡大が示された。
実際、ナノアルミナ処理マウスの脳では、アポトーシスの刺激に直接関与するいくつかの遺伝子（Bcl2l1、Bid、Fasなど）の発現が増加していることが確認された。しかし、ナノアルミナへの曝露は、サイトカイン産生やMAPKシグナル伝達経路を制御する遺伝子も誘導しており、ナノアルミナによる脳血管毒性は、オートファジーはいくつかの要因の一つに過ぎず、複雑なプロセスであることが示された。
また、ナノアルミナへの曝露は、BBBの完全性の維持に関与するタイトジャンクションタンパク質、オクルディンおよびクラウディン-5の発現を減少させた。このような効果は、Rho や Ras-MAPK などのシグナル伝達経路の活性化19 や、マトリックスメタロプロテアーゼやプロテアソームのタンパク質分解活性化など、いくつかの異なるメカニズムで実行されている可能性がある15。このPCRアレイの結果は、MAPK経路の遺伝子を刺激することを同定し、タイトジャンクションタンパク質の発現制御におけるこのシグナル伝達経路の重要性に関する我々の以前の発見と一致している15、19、20。Wortmanninによる前処理は、ナノアルミナによって誘発されたクローディン-5の変化を部分的に保護したが、オクルディンは保護しなかったことから、選択されたタイトジャンクションタンパク質の制御におけるオートファギーの関与が可能だと示唆された。これは新しい観察であるが、ワートマニンはオートファジーの選択的阻害剤ではなく、その効果にはPI-3キナーゼの阻害が含まれるため、この結果は慎重に解釈されるべきである21。
CNS におけるナノアルミナの持続的な蓄積は、脳を急性および/または慢性の神経学的障害の発症に向かわせる可能性がある。実際、ナノアルミナへの曝露は、非常に強い神経血管および神経炎症成分を有する脳卒中の転帰を悪化させる可能性があることが示された。我々は、ナノアルミナによって誘発される酸化ストレス、炎症反応5,6、さらに曝露された脳におけるオートファジー活性の増強が、脳卒中の発症に寄与しているのではないかと推測している。重要なことは、ナノアルミナへの一過性の曝露でも、オートファジーの活性化、タイトジャンクションタンパク質の破壊、BBB透過性の上昇などの影響が、最初の曝露から30日間という長期にわたって持続する可能性があることを示すことである。
本研究では、ナノ粒子の潜在的な非特異的効果を制御するために、ナノカーボンをナノアルミナと等モル濃度で使用した。ナノアルミナは曝露した動物の細胞や脳に強い毒性を示したが、ナノカーボンは著しく低い毒性しか示さなかった。これらの結果は、ENM のサイズだけでなく、その化学的・物理的特性、表面改質、電荷、およびその他の特性が、ナノ粒子の生物活性と毒性に影響することを明確に示している。したがって、ENM のナノ毒性を個別に調査し、取り扱い戦略やリスク評価に関する適切な勧告を確立することが重要である1。
以上のことから、本研究は、ナノアルミナが脳内皮細胞および曝露動物の脳に蓄積し、神経血管障害とオートファジーの活性化を誘発することを実証した。重要なことは、ナノアルミナへの曝露が中枢神経系の脆弱性を高め、脳卒中などの神経血管障害の転帰を悪化させる可能性があることを示すことである。
図6
ナノアルミナへの曝露は虚血性脳障害を増悪させる
マウスにビヒクル、図1Bのようなナノアルミナ（nAl）、または等モル量のナノカーボン（nC）を脳循環に注入した。さらに、脳血管の流れを阻害しないように、選択したマウスに通常の粒子径のアルミナ（Al）を等モル量、i.p.注射した。ナノアルミナ投与3日後または30日後に左中大脳動脈を永久閉塞させた．脳卒中誘発24時間後に梗塞体積を評価した．結果は平均値±SEMである。**ビヒクル投与マウスと比較して、p<0.01で有意差あり。
方法
細胞培養と処理因子
ナノアルミナ（粒子径 8-12 nm、Alfa Aesar, Ward Hill, MA）のストック溶液を蒸留水で調製し、細胞培養用培地または動物注射用PBSで希釈し、凝集体の生成を防ぐために投与前に15分間超音波処理を施した。粒度分布は、Delsa™Nano C Particle Analyzer (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) を使用して動的光散乱 (DLS) により測定されました。ナノアルミナ懸濁液は、大きな凝集体 (~4,400 nm) と小さな断片 (<1,000 nm) を含む二相性のパターンを示しました。15分間の超音波処理により、これらの凝集体は平均サイズ241±27.6 nmのより小さな成分に変換された。
細胞や組織への取り込みを検出するために、ナノアルミナのストック溶液を10mMリン酸ナトリウム溶液（pH7.4）中の0.9mM ARSに加え、15分間撹拌してアリザリンレッドS（ARS、Sigma、セントルイス）でラベルした9-10 ARSラベルしたナノアルミナは、テキサスレッドチャンネル（ex：595 nm, em：615 nm）を使用して蛍光顕微鏡下で検出された。
ARSは、アリザリンのオルト置換エネジオール配位子と水酸基を保持し、ナノアルミナへの高親和性結合を可能にしている。ARS標識ナノアルミナを水溶液中で7日間保持しても、蛍光の減少は10%未満であり、標識は安定であることが確認された。重要なことは、この標識は非標識ナノアルミナと比較して粒度分布を変化させなかったことである。
一部の実験では、オートファジーを阻害するためにウォルトマンニン（PI3キナーゼ阻害剤；100 nM；シグマ社）を用い、オートファゴソーム蓄積の誘導剤としてクロロキン（50 μM；シグマ社）を採用した11-12。
動物の扱い、外科的処置、組織の準備
すべての実験は、米国国立衛生研究所のガイドラインに厳格に従い、Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルに従って実施された。C57BL/6 マウス（雄、10-12 週齢、Harlan, Indianapolis, IN）は、ビヒクルまたはナノアルミナ（1.25 mg/kg）または対照物質を脳循環に直接投与するために頸動脈手術を受けた13。
脳を取り出し，皮質を蒸留水でホモジナイズした後，ATP assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) を用いて ATP 含有量を測定した．免疫染色解析のために，脳を生理食塩水に加えて4％ホルムアルデヒドで灌流した後，20 μmスライスに切り出した13．中大脳動脈永久閉塞による脳梗塞実験モデルを作成した．24時間後に2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色で梗塞体積を求め，ImageJソフトで算出した．
ミトコンドリア電位、ライソゾーム形成、オートファジー活性、タンパク質分解アッセイ
HCMECを2ウェルスライド（BD, Bedford, MA）で培養し、ナノアルミナまたはコントロール因子で処理し、MitoTracker Red CMXRos Red（Invitrogen, Carlsbad, CA）および／またはLysoTracker® Green（Invitrogen）11,14 で染色し、15分24時間モノダンシリカダベリン（MDC、Sigma）で共染色しオートファジー空胞の検出と蛍光顕微鏡での観察も実施した。
タンパク質の分解は，DQ-BSA（Invitrogen）を基質として，製造元の指示に従い調べた．
タイトジャンクションタンパク質とオートファジー関連タンパク質の発現
タイトジャンクションタンパク質（クローディン-5、オクルディン）およびオートファジー関連タンパク質（LC3、p62）の発現を免疫ブロッティングにより評価した。抗クローディン-5抗体および抗オクルーディン抗体はInvitrogen社製を使用した。LC3およびp62に対する抗体は、それぞれnanoTools（Teningen，Germany）およびAmerican Research Products（Belmont，MA）より購入した。
LC3 の発現は、脳切片の免疫染色によっても解析した。切片は、Factor VIII（内皮細胞のマーカー）またはGFAP（アストロサイトのマーカー）に対して共染色した。両抗体はInvitrogen社から購入し、1:400の希釈率で使用した。
オートファジー関連遺伝子の発現
オートファジー関連遺伝子は、マウスオートファジーPCRアレイ（Qiagen、Valencia、CA）により脳内で評価された。結果は、市販のプライマーとプローブを用いた定量的リアルタイムPCRによるLC3 mRNAの発現の決定によって検証された。LC3 mRNAレベルは、GAPDH mRNAの発現量に対して正規化した。
統計解析
一元配置分散分析に続いて、Newman-Keuls多重比較検定を使用して、処理間の平均反応を比較した。p<0.05の統計的確率を有意とみなした。
